KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI HỌC
1. Một số ký thuật cơ bản
1.1. Chuẩn bị nguyên liệu
Nguyên liệu để nghiên cứu có thể ở dạng tươi hoặc khô, khi
kiểm nghiệm dược liệu tùy mục đích mà xử lý khác nhau. Nguyên liệu tươi ngay
sau khi thu hái có thể dùng để làm các lát cắt, đôi khi được cố định trong các
dung dịch khác nhau. Nguyên liệu khô phải làm mềm. Nghiên cứu đặc điểm các tổ
chức, tế bào có thể tiến hành trên nguyên liệu đã được ngâm mềm.
1.1.1. Cố định nguyên
liệu
Mục đích của cố định trong kiểm nghiệm dược liệu là giữ lại
trong mô, tế bào dược liệu các cấu trúc, các hoạt chất cần thiết cho những quá
trình nghiên cứu tiếp theo. Tùy thuộc vào nguyên liệu, mục đích nghiên cứu mà
tiến hành cố định trong các điều kiện khác nhau:
- Nghiên cứu giải phẫu thực vật, tế bào học, cần quan sát các
thành phần cấu trúc chứa trong mô, tế bào, cần cố định bằng các chất định hình
như Carnua, FAC, Navasin v.v...
- Xác định hesperidin trong vỏ cam, quít v.v... cần cố định
nguyên liệu trong cồn.
- Nghiên cứu alkaloid thường cố định thực vật trong dung dịch
acid picric hoặc dung dịch các thuốc thử alkaloid.
- Nghiên cứu tanin trong dược liệu thường cố định trong dung
dịch Kali cromat, chì acetat...
1.1.2. Làm mềm nguyên liệu
Các dược liệu khô, cứng khi làm tiêu bản cần làm mềm trước,
có nhiều phương pháp làm mềm: làm mềm lạnh, làm mềm trong buồng ẩm, làm mềm
nóng ...
Làm mềm lạnh: Các phần cây: rễ, quả, hạt, các bộ phận dưới đất,
thường tiến hành làm mềm bằng cách cho vào hỗn hợp Nước - Glycerin - Ethanol (1:1:1) mẫu được giữ
cho đến khi các mô thấm no chất lỏng, theo cách này mất nhiều thời gian (tùy
thuộc vào độ dày của mẫu và cấu trúc các mô mà ngâm vài ngày đến vài tuần)
nhưng rất tốt bởi vì không khí được giải phóng ra khỏi các mô và một phần được
làm sáng.
Phương pháp làm mềm đơn giản thường được sử dụng nhất: Ngâm
mẫu vào nước một vài giờ sau khi mềm chuyển vào hỗn hợp Glycerin - Ethanol
(1:1) hay Nước - Glycerin - Ethanol
(1:1:1) giữ ở trong hỗn hợp 1 - 3 ngày. Trong hỗn hợp này mẫu có thể bảo quản
lâu dài. Khi cần mẫu chắc hơn bỏ vào hỗn hợp Glycerin - Ethanol (1:2) ngâm một
thời gian.
Làm mềm trong buồng ẩm: Có thể sử dụng bình hút ẩm kín. Cho
nước vào bình và mẫu vào bát nhỏ, thả nổi bát trong bình. Mẫu không tiếp xúc với
nước mà chỉ bị ẩm bởi hơi nước trong bình, phương pháp này tốn thời gian song
là phương pháp tốt nhất vì nó đảm bảo giữ được cấu trúc tế bào và các thành phần
khác mà không bị rửa đi, thăng hoa, trương phồng, nhầy hoá - là những hiện tượng
thường xảy ra khi sử dụng các phương pháp làm mềm khác. Với dược liệu mềm, mỏng,
làm ẩm khoảng một ngày, dược liệu cứng khoảng 2-3 ngày, để tránh mốc có thể xảy
ra trong quá trình làm ẩm người ta thêm vào nước một ít phenol hoặc formaldehyd. Nhược điểm của
phương pháp làm ẩm này là trong dược liệu còn lại nhiều khí cần phải loại khi
làm tiêu bản.
Làm mềm nóng: là phương pháp đơn giản và nhanh, cho những mẩu
dược liệu dài 2-3 cm vào nước, đun sôi. Vỏ thường đun khoảng 3-5 phút, các cơ
quan khác tùy độ rắn và mức độ hoá gỗ của mô mà đun sôi trong 10-30 phút. Quả
và hạt có thể làm ẩm bằng hơi nước, gói quả hay hạt vào vải màn, treo trong hơi
nước đun sôi 15-30 phút hay hơn tùy thuộc vào độ cứng của chúng. Lá và hoa
không yêu cầu xử lý lâu, phức tạp, để làm mềm và tẩy sáng đun chúng trong dung
dịch cloral hydrat 66%. Sau khi đun lấy ra, rửa sạch bằng nước và làm các lát cắt.
Ðặc điểm của phương pháp làm mềm nóng là làm trương nở thành tế bào và làm rửa
trôi chất tế bào.
1.1.3. Phương pháp ngâm mủn
Trong nghiên cứu thực vật nói chung và kiểm nghiệm vi học dược
liệu nói riêng thường sử dụng phương
pháp ngâm mềm. Ðó là phương pháp phân tách tế bào khác nhau nằm trong cấu tạo của
các loại mô. Bằng cách này màng gắn giữa các tế bào bị phá hủy, các tế bào tách
rời nhau mà không bị hư hại do vậy ta có thể nghiên cứu chi tiết cấu tạo của từng
tế bào một từ khắp mọi phía. Phương pháp ngâm mủn có ý nghĩa quan trọng trong
nghiên cứu giải phẫu thực vật đặc biệt trong kiểm nghiệm dược liệu bằng phương
pháp soi bột.
Tùy từng loại dược liệu mà sử dụng các phương pháp ngâm mềm
khác nhau, cơ sở của đa số các phương pháp này là xử lý mô bằng acid mạnh, các
acid sẽ thủy phân màng giữa làm nhiệm vụ nối các tế bào với nhau, một số trường
hợp ngâm mềm bằng kiềm. Ngày nay người ta thường ngâm mềm bằng men pectinase,
khi dùng men quá trình thủy phân xảy ra trong điều kiện ôn hoà hơn nên không
làm hỏng tế bào. Với nguyên liệu cứng rắn như gỗ có thể ngâm mủn bằng cách đun
các mảnh nguyên liệu trong HNO3
10% khoảng vài phút, khi đạt độ mủn rửa sạch bằng nước rồi đặt vào một
giọt nước trên phiến kính, dùng kim nhọn để tách rời các tế bào. Nếu nguyên liệu
được xử lý tốt thì chỉ cần đậy lá kính rồi ấn nhẹ lên lá kính là các tế bào tự
tách rời nhau. Người ta đánh giá quá trình ngâm mủn theo mức độ vụn nhỏ của mô
khi ép dưới lá kính. Với nguyên liệu rắn có thể dùng dung dịch ngâm mủn
Schulze: cho những mẩu nguyên liệu nhỏ vào ống nghiệm có chứa hỗn hợp 2 ml HNO3 đậm đặc và 0,3 g Kali clorat
đun đến khi tạo bọt (tiến hành nơi thoáng gió hoặc trong tủ hốt) và để một vài
phút cho đến khi mẩu nguyên liệu bị tẩy trắng. Ðể nguội, lấy nguyên liệu ra, rửa
sạch bằng nước rồi tiến hành tiếp tục như trên. Với nguyên liệu rắn còn có thể
ngâm mủn bằng hỗn hợp HNO3 10% và Kali dicromat 10% theo tỷ lệ 1:1
ngâm 24-48 giờ ở 600C (Hỗn hợp này có thể dùng để ngâm mủn nguyên liệu
mềm trong 24 giờ ở 30oC). Với nguyên liệu mềm như lá cây, chồi, các
loại thân cỏ có thể ngâm mủn trong dung dịch acid cromic 1% trong nước một vài
ngày, có thể đun nhẹ để phản ứng nhanh hơn hoặc ngâm mủn bằng acid cromic 5% hoặc
HCl 1N, ngâm mẫu trong các dung dịch này ở 30oC trong vài giờ, sau
khi ngâm rửa sạch và tiến hành như mô tả ở trên. Với nguyên liệu có chứa các ống
tiết, ống nhựa mủ, túi nhựa và tinh dầu v.v... sử dụng phương pháp ngâm mủn bằng
kiềm sẽ tách các mô mà không làm hỏng thành mỏng của các tế bào. Tiến hành cụ
thể như sau: Ðun sôi nguyên liệu trong NaOH 3-5% trong vòng 30 phút hoặc đun
nóng trong dung dịch NH4OH 25% khoảng 40 phút.
Ðối với các mẫu cây thảo, còn tươi thường dùng phương pháp
tách bằng enzym. Mô được ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ với
pectinase 5% sau khi rửa để loại enzym tiến hành tiếp tục như trên.
Thông thường trong các mô có chứa khí ngăn cản quá trình
thâm nhập của các tác nhân gây mủn vì vậy với các mẫu ngâm mủn bằng phương pháp
không đun nóng cần phải đun sôi trước trong nước để loại không khí hoặc tiến
hành loại không khí trong điều kiện chân không, cụ thể: thả những mẩu mô nhỏ
(thường nhỏ hơn 0,5cm) vào nước chứa trong bình, nối với bơm chân không, không
khí trong bình được hút ra trong vòng 10-12 phút, lặp lại vài lần.
1.2. Chuẩn bị và nghiên cứu tiêu bản hiển vi
Tiêu bản hiển vi thường được làm từ dược liệu đã được xử lí
sơ bộ (1.1.). Cách làm tiêu bản phụ thuộc vào các đặc điểm hình thái, trạng
thái của nguyên liệu (nguyên vẹn, các mảnh bị cắt rời, bột...) và mục đích
nghiên cứu. Cơ sở của kiểm nghiệm hiển vi là giải phẫu thực vật và hoá thực vật
(dựa vào các đặc điểm thực vật cũng như dựa vào các phản ứng vi hoá, mô hoá),
trong quá trình kiểm nghiệm hiển vi cần có hiểu biết sâu sắc về cấu tạo giải phẫu,
các cơ quan của cây cũng như trạng thái tồn tại, tính chất hoạt chất của dược
liệu. Những kiến thức này có vai trò quan trọng trong việc xác định các đặc điểm,
các phản ứng đặc trưng của đối tượng nghiên cứu, cho phép phân biệt các cơ quan
tương tự của các dược liệu khác nhau. Sau đây là một số vấn đề cần lưu ý khi kiểm
nghiệm dược liệu từ các cơ quan khác nhau.
1.2.1. Lá
Lá mỏng có thể quan sát dưới kính hiển vi không cần cắt lát,
thông thường để tẩy sáng mô lá khô đun sôi lá trong dung dịch kiềm hoặc trong
dung dịch cloral hydrat 30% trong vòng 10-15 phút. Các lá nhỏ khi tẩy sáng lấy
cả lá, lá to hoặc lá bị cắt nhỏ lấy các phần khác nhau có chứa các yếu tố có thể
dùng để chẩn đoán như mép lá, răng lá, gân chính, bề mặt trên, dưới v.v... Lá
hoặc các mẩu lá sau khi tẩy sáng rửa bằng nước, lên kính trong glycerin hoặc
dung dịch cloral hydrat. Lá dày cần phải làm các lát cắt ngang, một số lá có thể
dùng dao sắc để tách phần biểu bì ra khỏi thịt lá.
Ðể nghiên cứu bột lá dùng kim mũi mác lấy một lượng nhỏ bột
cho lên phiến kính đã có sẵn 2-3 giọt
dung dịch cloral hydrat, nghiền bột cho thấm dung dịch, đặt phiến kính và đun
nóng 2-3 phút để làm trong các mô lá (có thể đun đến khi tạo bọt khí), sau khi
để nguội di nhẹ lên lá kính để tạo nên lớp bột mỏng, không chồng chéo lên nhau.
Cần chú ý làm sạch lá kính và đủ chất lỏng để soi. Lá có chứa nhiều chất diệp lục
làm sáng trong dung dịch như trên ít có hiệu quả. Trong trường hợp này có thể
làm trong bột lá bằng dung dịch NaOH 3%, khi đun nóng dung dịch nhanh chóng bay
hơi vì vậy cần chú ý theo dõi để tiêu bản không bị khô. Sau khi đun nóng cần
thêm 1-2 giọt glycerin để ngăn cản sự kết tinh của kiềm và làm cho tiêu bản lâu
khô. Các yếu tố đặc trưng chủ yếu để kiểm nghiệm lá là biểu bì, lông che chở,
lông tiết, tuyến, tinh thể.
Biểu bì: Lá của các cây khác nhau đặc trưng bởi các dạng tế
bào biểu bì xác định, ở một số cây tế bào biểu bì có dạng uốn khúc nhiều hoặc
ít, ở một số có nhiều góc, có khi tế bào biểu bì bị kéo dài rõ rệt theo một hướng
v.v... Kích thước của tế bào biểu bì là một trong các yếu tố đặc trưng để xác định
các cây. Tế bào biểu bì thường được bọc bởi một lớp màng mỏng cấu tạo từ cutin,
đa số trường hợp cutin có bề mặt nhẵn song đôi khi tạo thành các nếp gấp thẳng
hoặc lượn sóng, hay có những chỗ lồi dưới dạng u, mấu. Các đặc điểm của lớp
cutin bao phủ biểu bì cũng như chiều dày của nó đặc trưng cho một số loại cây
có ý nghĩa trong kiểm nghiệm dược liệu. Chiều dày của lớp cutin có thể quan sát
rõ khi nhuộm tiêu bản (lát cắt ngang) bằng dung dịch Sudan III. Biểu bì lá có các lỗ khí, dạng của
lỗ khí, sự phân bố của chúng (ở một mặt, hai mặt lá) và đặc điểm của các tế bào
biểu bì bao quanh là những đặc điểm đặc trưng đối với mỗi dạng cây hoặc họ và
là những đặc điểm có ý nghĩa trong kiểm nghiệm. Dựa vào đặc tính phân bố của lỗ
khí và các tế bào biểu bì bao quanh người ta phân biệt ra nhiều kiểu:
- Kiểu lỗ khí không có tế bào kèm (Kim ngân)
- Kiểu hỗn bào: lỗ khí bao bọc bởi tế bào giống như tế bào
biểu bì, không có tế bào phụ (họ Hoàng liên)
- Kiểu trực bào: lỗ khí bao bọc bởi hai tế bào phụ nằm thẳng
góc với trục dọc của lỗ khí (họ Cẩm chướng).
- Kiểu song bào: lỗ khí bao bọc bởi hai tế bào phụ nằm song
song với trục dọc của nó (họ Cà phê)
- Kiểu dị bào: lỗ khí bao bọc bởi ba tế bào phụ một tế bào
nhỏ hơn rõ rệt so với hai tế bào kia (họ Cải) v.v...
Số lượng lỗ khí (số lỗ khí trên 1 mm2 biểu bì) và chỉ số lỗ
khí (tỷ lệ lỗ khí và số tế bào biểu bì trên một đơn vị diện tích) thường là những
đại lượng cố định đối với một loài, trong nhiều trường hợp chúng cho phép phân
biệt các loài của cùng một chi.
Ở các lát cắt ngang
phiến lá khi quan sát mô giậu có thể thấy một hàng hay hai hàng, có thể chỉ có ở
mặt trên hoặc cả hai mặt. Tỷ lệ mô giậu (số tế bào của mô giậu dưới mỗi tế bào
biểu bì) cũng có ý nghĩa đặc trưng cho các loài.
Lông: Ở phần lớn thực vật tế bào biểu bì mọc dài ra tạo
thành lông. Lông có thể có ở nhiều phần của cây, chúng có thể tồn tại trong suốt
đời sống của một cơ quan, hoặc chỉ một thời gian. Lông thường hết sức khác nhau
trong các họ cây, các nhóm cây nhỏ hơn và ngay trong cùng một cây, đôi khi lại
có sự khá đồng nhất về lông trong phạm vi một nhóm cây. Lông có thể phân chia
thành nhiều loại hình thái khác nhau, về mặt cấu trúc lông có thể chia thành loại
đơn bào và đa bào. Lông đơn bào có thể phân nhánh hay không phân nhánh. Lông đa
bào có thể bao gồm một dãy tế bào riêng lẻ hoặc phân nhánh. Một số lông có các
nhánh toả ra nhiều hướng trong một mặt phẳng (lông hình sao). Thường một lông
đa bào có thể phân chia thành phần chân (phần bám vào biểu bì) và phần lồi trên
bề mặt. Những tế bào quanh chân đôi khi về mặt hình thái khác hẳn với tế bào biểu
bì khác. Có kiểu lông hình khiên gồm một phiến tế bào hình đĩa, phần nhiều được
sinh ra trên một cán hoặc đính trực tiếp vào chân. Những lông đơn bào, đa bào
và hình khiên có thể là lông tiết. Một số lông đa bào đơn giản có thể bao gồm một
chân và một đầu đơn bào hoặc đa bào, các đầu thường tạo thành phần tiết của
lông. Bề mặt lông có thể nhẵn hay sần sùi tùy thuộc vào đặc điểm của lớp cutin
bao bọc. Kích thước của lông cũng rất khác nhau, ở một số cây lông có thể quan
sát bằng mắt thường, có cây phải dùng kính lúp, kính hiển vi. Sự đa dạng của
lông là một trong những yếu tố quan trọng nhất để phân biệt dược liệu. Người ta
cũng đã sử dụng thành công việc phân loại các chi, thậm chí các loài ở một số họ
và trong việc nhận biết cây lai giữa các loài dựa vào kiểu lông.
Các tuyến tiết, túi tiết, ống nhựa mủ: Trong lá nhiều cây có
chứa tinh dầu, vị trí tinh dầu có thể rất khác nhau, ở một số cây tinh dầu chứa
trong các tuyến tiết nằm trên bề mặt biểu bì (Bạc hà, Hương nhu) một số cây
khác tinh dầu chứa trong các túi tiết (lá Bạch đàn). Cấu tạo của túi tiết, tuyến
tiết tinh dầu thường đặc trưng cho mỗi chi cây, có khi đặc trưng cho toàn họ.
Ví dụ họ Bạc hà có tinh dầu chứa trong các lông tiết hình bánh xe, nhiều cây
trong họ Cúc có tuyến tiết gồm hai hàng tế bào xếp thành 3-4 lớp. Một số cây có
các túi tiết, ống tiết đặc biệt chứa tinh dầu, nhựa, nhựa mủ. Ðặc điểm và phân
bố của tuyến tiết tinh dầu, các túi tiết, ống tiết với tinh dầu, nhựa, nhựa mủ
trong đó là những đặc điểm đặc trưng để phân biệt các nguyên liệu khác nhau khi
kiểm nghiệm dược liệu.
Tinh thể: Trong cây thường gặp các tinh thể calci oxalat,
đôi khi có tinh thể của các chất khác
như calci sulfat, calci cacbonat, oxyt silic (SiO3). Dạng của các
tinh thể rất khác nhau và đặc trưng đối với mỗi loài cây, có khi đặc trưng cho
chi thậm chí cho cả họ. Calci oxalat thường gặp dưới dạng đơn hoặc kép, hình
lăng trụ, hình kim, bó, cầu gai, cát có khi tập trung thành khối, thông thường
trong một cây calci oxalat thường ở một dạng nào đó, có những cây calci oxalat ở
2-3 dạng. Hình dạng các tinh thể cũng như vị trí của chúng có ý nghĩa trong kiểm
nghiệm dược liệu. Các tinh thể calci oxalat không hoà tan trong nước và trong
acid acetic mà hoà tan trong acid hydrocloric, acid nitric, acid sulfuric. Khi
tác dụng với acid sulfuric xảy ra quá trình hoà tan tinh thể và lại tạo nên
tinh thể calci sulfat, quá trình này xảy ra nhanh và có thể quan sát dưới kính
hiển vi. Ðể quan sát tinh thể calci oxalat trong các cơ quan có thể sử dụng các
chất lỏng làm sáng tiêu bản như cloral
hydrat, lactophenol.
Khi nghiên cứu tinh thể nên sử dụng kính hiển vi phân cực vì
dưới kính hiển vi phân cực thấy rất rõ các tinh thể, thậm chí có thể quan sát
được những mảnh tinh thể rất nhỏ. Ðể nghiên cứu tinh thể dưới kính hiển vi phân
cực có thể làm các tiêu bản cố định không nhuộm màu trong bôm Canađa. Trong lá
một số cây có chứa nang thạch (đá túi) cũng là đặc điểm đặc trưng khi kiểm nghiệm
dược liệu.
Khi nghiên cứu lá đã nghiền nhỏ một số yếu tố có thể bị biến
dạng song phần lớn vẫn giữ nguyên dạng và các đặc điểm của chúng, đó là những yếu
tố để xác định dược liệu khi kiểm nghiệm.
1.2.2. Hoa
Trước khi làm tiêu bản cần làm mềm hoa hoặc các bộ phận của
hoa (1.1.2.), sau khi rửa sạch bằng nước, đặt lên phiến kính trong một giọt chất
lỏng để soi (nước, glycerin, dung dịch cloral hydrat) dùng kim mũi mác làm cho
phẳng, đậy lá kính, nung nóng để loại không khí, nghiên cứu dưới kính hiển vi bề
mặt các bộ phận của hoa. Các yếu tố có ý nghĩa trong kiểm nghiệm vi học hoa là:
hạt phấn, biểu bì trong, ngoài của cánh hoa, đài hoa, lá bắc, tế bào của cuống
hoa, lông, tinh thể calci oxalat, tuyến tiết tinh dầu...
Phân tích bột hoa cần chú ý tới các hạt phấn, các mảnh mô với
tinh thể (nếu có), các mảnh biểu bì cánh hoa, các yếu tố cơ giới của lá bắc,
lông. Trong nhiều trường hợp hạt phấn là yếu tố định hướng trong kiểm nghiệm.
1.2.3. Thân thảo
Xác định thân thảo chủ yếu theo lá, cần làm tiêu bản từ lá
hoặc các mẩu lá (nếu dược liệu bị cắt nhỏ). Khi nghiên cứu thân thảo không có
lá làm tiêu bản biểu bì và lát cắt ngang thân. Dược liệu phải được làm mềm
(1.1.2.), làm tiêu bản, lên kính bằng nước, glycerin hay dung dịch cloral
hydrat quan sát bề mặt biểu bì và cấu trúc giải phẫu. Với các mẩu thân bị cắt
nhỏ có thể nghiên cứu bằng phương pháp ngâm mủn (2.1.3.) Làm tiêu bản từ bột dược
liệu thân thảo cũng tiến hành như bột từ lá, không nên lấy những mảnh thân lớn
vì khó làm sáng, hơn nữa những mảnh này ít có ý nghĩa trong kiểm nghiệm và gây
khó khăn khi làm tiêu bản. Xác định dược liệu thân thảo tiến hành như với lá vì
vậy những yếu tố có ý nghĩa trong kiểm nghiệm lá cũng có ý nghĩa trong kiểm
nghiệm thân thảo. Bột cây thân thảo được phân biệt ở chỗ ngoài những yếu tố, đặc
điểm của lá còn gặp các yếu tố, đặc điểm của thân, hoa, các bộ phận của quả. Với
thân đặc điểm quan trọng nhất là biểu bì và hình dạng tế bào biểu bì. Mảnh mạch
của thân thường lớn và thẳng phân biệt với mảnh mạch nhỏ, phân nhánh của lá.
Trong bột dược liệu thân thảo thường gặp các yếu tố từ hoa như hạt phấn, biểu
bì cánh hoa, nhị, các yếu tố từ quả như tế bào biểu bì vỏ quả, nếu quả chín có
thể thấy các lớp vỏ hạt, các mảnh nội nhũ với dầu béo, các giọt dầu béo.
1.2.4. Vỏ
Khi nghiên cứu vỏ thường làm các lát cắt ngang và dọc.
Nguyên liệu sau khi xử lý (1.1.) tiến hành làm các lát cắt, lên kính trong dung
dịch cloral hydrat, nước hay glycerin, đậy lá kính và đun nóng để làm sáng tiêu
bản và loại không khí. Ðể làm rõ các cấu trúc hay hoạt chất xử lý lát cắt bằng
các thuốc thử tương ứng.
Khi nghiên cứu các lát vỏ cắt ngang dưới kính hiển vi cần
chú ý tới độ dày và đặc điểm cấu tạo của lớp bần, chiều rộng của tia tủy, các yếu tố cơ giới
như sợi, libe, tế bào mô cứng, thể cứng, cấu tạo, phân bố và số lượng của
chúng. Cấu tạo, kích thước của sợi, tế bào mô cứng quan sát rõ hơn trên các lát
cắt dọc. Trong vỏ một số cây có ống nhựa mủ hay túi chứa tinh dầu có ý nghĩa
trong kiểm nghiệm dược liệu.
Hầu như trong vỏ luôn có tinh thể calci oxalat chúng thường
phân bố trong các mô mềm. Tinh bột cũng thường có trong mô mềm vỏ nhưng không
có ý nghĩa kiểm nghiệm vì hầu như tất cả các hạt tinh bột gần tương tự nhau: nhỏ,
hình tròn hoặc hình trái xoan. Các phản ứng vi hoá để phát hiện hoạt chất cũng
như phản ứng xác định sự hoá gỗ của các yếu tố vỏ có vai trò lớn khi kiểm nghiệm.
1.2.5. Quả, hạt
Khi nghiên cứu quả, hạt dưới kính hiển vi người ta thường
làm các lát cắt ngang. Ðể nghiên cứu toàn diện cần làm và quan sát các lát cắt
ngang qua các phần khác nhau của quả, hạt và nghiên cứu chi tiết ở những lát cắt
phần giữa vì ở đó các yếu tố cấu trúc được thể hiện đầy đủ nhất. Ðể làm các lát
cắt từ quả, hạt nhỏ cần cố định trong parafin và đặt chúng cẩn thận đúng theo
hướng xác định.
Vỏ quả có ý nghĩa quan trọng nhất trong kiểm nghiệm quả. ở một
số quả vỏ quả có các ống, túi tiết tinh dầu, số lượng và phân bố của chúng là
những đặc trưng chủ yếu đối với từng loại quả xác định.
Số lượng hạt, dạng hạt, phân bố của hạt trong quả, mô cơ giới
của vỏ quả, lông biểu bì quả cùng với các phản ứng vi hoá xác định chất béo,
tinh dầu, các yếu tố hoá gỗ v.v... là các vấn đề có ý nghĩa trong kiểm nghiệm
quả, bột quả.
Khi nghiên cứu hạt dưới kính hiển vi cần chú ý tới cấu trúc
chung của hạt (Ðặc điểm vỏ hạt, độ lớn các mô dinh dưỡng, nội nhũ, dạng và vị
trí của phôi, rễ mầm, các lá mầm) hình dạng, kích thước tế bào vỏ hạt có ý
nghĩa phân biệt. Cấu tạo nội nhũ và các mô của phôi (trừ một vài dược liệu - Mã
tiền, quả họ Cần) thường không khác nhau nhiều. Khi nghiên cứu bột hạt đặc điểm
của lớp vỏ hạt là đặc trưng quan trọng nhất.
1.2.6. Rễ, rễ củ và các cơ quan dưới đất
Nghiên cứu hiển vi các cơ quan này tiến hành làm tiêu bản
cũng như với các cơ quan khác song vì tinh bột là yếu tố có ý nghĩa lớn trong
xác định nguyên liệu nên khi làm mềm (1.1.2.) cần sử dụng các phương pháp lạnh
để giữ nguyên trạng thái của chúng. Nghiên cứu đặc điểm phân bố các mô dẫn (bó
mạch dẫn) cần làm lát cắt qua tất cả các phần của rễ hay củ rễ và quan sát ở độ
phóng đại nhỏ. Sau đó nghiên cứu chi tiết các cấu trúc, thành phần các mô với độ
phóng đại lớn. Số lượng các lát cắt không cần nhiều song phải đại diện cho tất
cả các phần có chứa các yếu tố khác nhau. Ðầu tiên thường nghiên cứu các lát cắt
không đun nóng để nhận xét sự có mặt của tinh bột, hình dạng và kích thước của
chúng, sau đó đun nóng tiêu bản để tẩy sáng và nghiên cứu các đặc điểm giải phẫu.
Thường sử dụng cloral hydrat làm chất lỏng lên kính, ít khi dùng glycerin và nước.
Ðể nghiên cứu cấu trúc hay các chất thường xử lý lát cắt bằng các thuốc thử
tương ứng. Nghiên cứu bột rễ và rễ củ thường bắt đầu với việc xác định các chất
dinh dưỡng dự trữ, lên kính bột dược liệu trong nước hay trong dung dịch Lugol
(đối với tinh bột) hay trong dung dịch Sudan III (đối với dầu béo). Ðể nghiên cứu
những mảnh mô riêng biệt cần quan sát trong dung dịch cloral hydrat sau khi đun
nóng (làm sáng). Ðặc điểm cấu tạo, phân bố của các mô dẫn (gỗ, libe), sự biến đổi
của chúng trong quá trình phát triển cá thể cùng với các đặc điểm giải phẫu
khác (sợi, thể cứng, ống nhựa mủ, túi chứa tinh dầu, nhựa, hạt tinh bột, tinh
thể) có ý nghĩa quan trọng trong kiểm nghiệm. Kết quả các phản ứng vi hoá định
vị hoạt chất làm tăng thêm độ xác thực.
1.3. Các chất lỏng dùng để soi và làm sáng
Ðặc tính môi trường để soi đặc biệt là những chất làm sáng
tiêu bản có ý nghĩa rất quan trọng trong kỹ thuật vi học. Làm sáng tiêu bản tức
là làm cho đối tượng nghiên cứu trở nên sáng hơn, rõ ràng hơn bằng cách loại bỏ
ảnh hưởng của các thành phần trong tế bào cản trở sự quan sát. Các chất lỏng có
thể làm sáng bằng tác dụng hoá học, dẫn tới phân hủy, hoà tan, làm mất màu tất
cả những thành phần “thừa” trong tiêu bản nghiên cứu hoặc bởi tác động vật lý
vì có những chất trơ về mặt hoá học nhưng có hoạt tính quang học, tạo ra những
điều kiện xác định để ánh sáng xuyên qua tiêu bản làm cho các chi tiết của đối
tượng được quan sát tốt hơn. Các đối tượng quan sát được càng rõ khi sự khác
nhau về chỉ số khúc xạ ánh sáng của nó với môi trường soi càng lớn. Các cấu
trúc thành tế bào cellulose có chỉ số khúc xạ
n=1,52. Chỉ số khúc xạ của
glycerin n=1,47, của lactophenol n=1,48. Khi các đối tượng có cấu trúc tế bào
mỏng, trong lên kính bằng nước (n=1,33) quan sát rõ hơn lên kính bằng glycerin
và lactophenol. Nếu đối tượng ít trong suốt cần sử dụng chất lỏng để soi có chỉ
số khúc xạ lớn, loại đối tượng này lên kính bằng glycerin và lactophenol sẽ
trong suốt hơn khi lên kính bằng nước.
Ðể làm sáng tiêu bản sử dụng các chất lỏng khác nhau, tùy
vào bản chất của đối tượng, mật độ (độ
sít) của mô, các cấu trúc tế bào. Thông thường dùng nước, glycerin. cloral
hydrat, kiềm, nước oxy già để soi và làm sáng. Ta lần lượt xét từng chất:
- Nước: là chất lỏng trung tính thường sử dụng để lên kính
vì nước không làm biến đổi hình dạng, độ lớn của tế bào, cấu trúc và màu của
mô. Các hạt tinh bột nhìn rõ trong môi trường nước, hạt alơron bị phân hủy, dầu
béo tập hợp lại thành giọt lớn, chất nhầy bị hoà tan, các mô tối khó phân biệt.
- Glycerin: Khi dùng pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:1
(glycerin không pha loãng hút nước từ mô làm nhăn rúm mẫu và làm biến dạng
chúng). Chỉ trường hợp khi nghiên cứu các chất hoà tan trong nước (Ví dụ: chất
nhầy) sử dụng glycerin không pha hoặc pha nó với cồn theo tỷ lệ 1:1. Glycerin
cũng là một chất lỏng trung tính nhưng so với nước nó có ưu điểm là lâu khô và
có tính chất làm sáng nhẹ, dưới tác dụng lâu dài của glycerin các mô trở nên
trong suốt hơn.
- Cloral hydrat: Sử dụng dưới dạng dung dịch đậm đặc trong
nước để làm sáng các lát cắt dày, bột dược liệu trên kính hiển vi. Cloral
hydrat là một trong những chất làm sáng tốt nhất, nó nhanh chóng thấm vào tế
bào, loại bọt khí ra. Trong cloral hydrat các hạt tinh bột trương ra, dầu béo
và tinh dầu ban đầu tập hợp lại thành giọt lớn hơn, sau đó dần dần bị hoà tan.
Protein, clorofin và các chất khác bị phá hủy, các mô có màu thẫm sáng lên, các
tinh thể không bị biến đổi. Thông thường đun nóng các mẫu khi cho vào dung dịch
cloral hydrat, đôi khi đun đến sôi nhẹ để tăng cường tác dụng làm sáng và rút
ngắn thời gian. Nhược điểm của cloral hydrat là làm biến dạng các mô do thành tế
bào trương phồng mạnh.
- Kiềm: sử dụng dung
dịch trong nước, nồng độ kiềm và thời gian xử lý tùy vào đối tượng nghiên cứu,
thường sử dụng dung dịch 3-5% đôi khi 10-15%. Dung dịch NaOH là chất làm sáng mạnh,
trong dung dịch NaOH hạt tinh bột trương phồng và bị hồ hoá. Khi tác dụng lâu
dài hay đun nóng dược liệu trong kiềm chất béo bị xà phòng hoá, protein bị hoà
tan, các mô thẫm sáng ra. Trong dung dịch kiềm thành tế bào giãn nở, thay đổi
hình dạng, kích thước và dễ bị vỡ khi bị tác động. Có thể dùng KOH hoặc NH4OH,
NH4OH có ưu điểm là ít làm giãn nở thành tế bào.
- H2O2: sử dụng dung dịch 3% để làm
sáng, nồng độ cao hơn H2O2 làm mủn các mô dược liệu.
1.4. Cách làm tiêu bản vi phẫu thực vật
Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu có thể tiến hành làm tiêu
bản dược liệu theo các quá trình khác nhau, tài liệu này giới thiệu phương pháp
làm tiêu bản vi phẫu thường sử dụng phổ biến trong nghiên cứu thực vật.
Tiêu bản tạm thời: Khi nghiên cứu cấu tạo giải phẫu cần xác
định nhanh, không giữ lại mẫu có thể làm tiêu bản đơn giản như sau:
1. Dược liệu tươi hay khô đã ngâm mềm cắt ngang hoặc cắt dọc
bằng lưỡi dao cạo hoặc dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay, chọn các lát cắt mỏng.
2. Ngâm nước Javen hay dung dịch cloramin để tẩy các chất có
chứa trong các tế bào, thời gian ngâm tùy loại nguyên liệu, có thể rút ngắn thời
gian bằng cách đun nóng.
3. Rửa nước: nếu vi phẫu có nhiều tinh bột cần tẩy thì sau
khi rửa ngâm hoặc đun trong cloral hydrat rồi rửa nước lần nữa.
4. Rửa bằng acid acetic.
5. Rửa bằng nước.
6. Nhuộm vi phẫu bằng lục iốt, lục metyl hoặc xanh metylen
thời gian nhuộm tùy vào quá trình bắt màu của đối tượng (thường khoảng 10 giây
đến 1 phút).
7. Rửa cồn, nếu dùng xanh metylen thì chỉ cần rửa bằng nước.
8. Nhuộm đỏ son phèn, thời gian nhuộm tùy đối tượng (có thể
từ khoảng 1 phút đến 1 giờ).
9. Rửa nước.
10. Ðặt vi phẫu vào một giọt glycerin trên phiến kính, đậy
lá kính, soi trên kính hiển vi.
Tiêu bản cố định: Tiêu bản sau khi nhuộm xong đã rửa bằng nước
(9) tiến hành tiếp tục như sau:
10. Loại nước lần lượt bằng cồn 30o, 50o,
70o, 95o và cồn tuyệt đối.
11. Lắc vi phẫu ba lần trong xylen.
12. Ðặt vi phẫu vào một giọt bôm canada trên phiến kính, đậy
lá kính, để ở chỗ thoáng 2-3 tuần.
Phần lớn ảnh vi phẫu trong tài liệu được chụp từ các tiêu bản
cố định theo quy trình này.
Vẽ sơ đồ tổng quát vi phẫu Dược liệu
Chụp ảnh vi phẫu dược liệu
2. Phân tích vi hoá dược liệu
Từ "phân tích vi hoá" dùng trong tài liệu này để
chỉ phương pháp phân tích dựa vào các phản ứng hoá học, quá trình vật lý quan
sát kết quả dưới kính hiển vi. Phân tích vi hoá bổ sung thêm tư liệu để định
tính dược liệu, cho phép phát hiện các chất trực tiếp trong mô và tế bào, cho
khả năng xác định vị trí hoạt chất trong các mô của dược liệu.
Các lát cắt để tiến hành phản ứng vi hoá không được mỏng
quá, phải có một vài lớp tế bào chưa bị phá hủy khi cắt, có chứa các chất
nghiên cứu. Có thể tiến hành phản ứng vi hoá trên lát cắt tươi, khô hay lát cắt
từ các dược liệu đã được ổn định bằng các phương pháp đặc biệt.
Phản ứng vi hoá cho phép phát hiện các chất với số lượng nhỏ
vì vậy phải đặc biệt chú ý đến sự lẫn tạp có thể xảy ra trong quá trình tiến
hành. Khi tiến hành phân tích vi hoá cần tuân thủ các nguyên tắc sau:
- Phương pháp chỉ có ý nghĩa trong trường hợp phản ứng tiến
hành là đặc trưng.
- Trong tất cả các trường hợp cần tiến hành song song với
các mẫu đối chứng. Kết quả có độ tin cậy cao khi tiến hành bằng những phương
pháp có bản chất khác nhau thu được kết luận như nhau.
- Cần tiến hành các phản ứng vi hoá với tác phong cẩn thận,
tỉ mỉ, chính xác. Ngoài ra cần chú ý tới các yếu tố có thể ảnh hưởng tới kết quả
nghiên cứu. Ví dụ: Nhiều thuốc thử không bền phải bảo quản ở những điều kiện đặc
biệt hoặc dùng thuốc thử mới pha. Một số phản ứng vi hoá yêu cầu tiến hành và
quan sát kết quả rất nhanh khi các chất nghiên cứu chưa bị phân tán hay các mô
chưa bị phá hủy bởi tác dụng của thuốc thử.
- Nhiều dược liệu khi đưa vào sử dụng được chế biến bằng các
phương pháp khác nhau: ngâm nước, đun, tẩm cồn, giấm v. v... khi phân tích vi
hoá dược liệu cần chú ý tới sự ảnh hưởng của các quá trình này.
2.1. Các phản ứng lên thành tế bào
2.1.1. Các phản ứng
lên thành tế bào cellulose (không hoá gỗ)
Cellulose là chất chủ yếu của thành tế bào thực vật, phần
non của cây thành tế bào cấu tạo chỉ từ cellulose tinh khiết. Khi các tế bào
già hơn thành tế bào thấm các chất hữu cơ, các chất khoáng khác nhau. Cellulose
gần như nguyên chất chỉ có ở các sợi bông, sợi lanh và một vài loại sợi khác.
Cellulose là một polisaccarit (C6H10O5) n phân
tử lớn, không hoà tan trong acid yếu và các dung môi khác, thành tế bào
cellulose trong suốt, có tính khúc xạ kép, chỉ số khúc xạ n=1,52.
- Phản ứng với Kẽm clorua - Iốt
Phản ứng tiến hành trên phiến kính. Ðặt lát cắt vào một giọt
nước cho giãn thẳng ra, thấm nước bằng giấy thấm, nhỏ một giọt thuốc thử lên
lát cắt, đậy lá kính, quan sát dưới kính hiển vi. Thành tế bào cấu tạo từ
cellulose tinh khiết (nguyên chất) sẽ có màu xanh tím hoặc màu hoa cà (thành đã
hoá gỗ hay hoá suberin thì có màu vàng nâu).
- Phản ứng hoà tan trong thuốc thử Sveize
Ðặt lát cắt vào một giọt thuốc thử trên phiến kính, đậy lá
kính và quan sát dưới kính hiển vi. Ban đầu thấy rõ các chi tiết cấu trúc thành
tế bào, sau đó chúng trương phồng và hoà tan dần dần, thành tế bào hoá gỗ, cutin
không hoà tan trong thuốc thử này.
2.1.2. Các phản ứng lên thành tế bào hoá gỗ
- Phản ứng với floroglucin và acid hydrocloric
Ðặt lát cắt lên phiến kính trong dung dịch floroglucin 1%
trong cồn. Hút thuốc thử bằng giấy lọc, nhỏ lên lát cắt một giọt acid
hydrocloric đặc qua 1-2 phút thêm một giọt glycerin, đậy lá kính và quan sát ở
kính hiển vi với độ phóng đại nhỏ, thành tế bào hoá gỗ có màu tím đỏ tươi, độ đậm
của màu xác định mức độ hoá gỗ.
- Phản ứng với Pemanganat Kali
Bỏ các lát cắt vào dung dịch KMnO4 1% trên mặt
kính đồng hồ, sau 5 phút rửa bằng nước và đặt vào acid hydrocloric 10% trong 2
phút, rửa sạch và chuyển lên phiến kính trong một giọt dung dịch NH4OH
đậy lá kính và quan sát, thành tế bào hoá gỗ nhuộm màu đỏ.
Phản ứng với floroglucin và với pemanganat Kali dùng để phát
hiện các thành phần khác nhau cuả lignin (gỗ) (lignin F và lignin M) vì vậy kết
quả thu được khi tiến hành hai phản ứng này có khi không trùng khớp.
Thành tế bào hoá gỗ dễ nhuộm màu bằng các thuốc nhuộm, thường
sử dụng safranin hay kết hợp nó với các thuốc nhuộm khác nhuộm thành tế bào
cellulose.
- Phản ứng với safranin
Các lát cắt cho vào lọ đậy kín có chứa safranin 1% trong cồn
50o, ngâm trong 30 phút, rửa bằng cồn 50o sau đó rửa bằng
cồn acid hoá (100 ml cồn thêm 2 giọt HCl
đậm đặc) để rửa màu ra khỏi các yếu tố không hoá gỗ (5-10 giây) chuyển lên phiến kính, soi trong
một giọt glycerin, thành tế bào hoá gỗ nhuộm thành màu đỏ.
- Phản ứng với safranin và xanh anilin
Ngâm các lát cắt trong dung dịch safranin 1% trong cồn 50o
trong 24 giờ, rửa bằng cồn 50o và chuyển vào dung dịch xanh anilin
1% trong cồn 2-3 phút, rửa bằng cồn 50o lại chuyển vào cồn acid hoá
vài giây, rửa bằng cồn có vết soda, sau đó lại rửa bằng cồn tinh khiết và đặt
vào một giọt glycerin, đậy lá kính, quan sát trên kính hiển vi: thành tế bào
hoá gỗ bắt màu đỏ, thành tế bào cellulose bắt màu xanh.
- Phản ứng với anilin sulfat
Ðặt lát cắt vào một giọt thuốc thử trên phiến kính, đậy lá
kính, quan sát trên kính hiển vi, thành tế bào hoá gỗ chuyển thành màu vàng.
- Phản ứng với paranitroanilin
Ðặt lát cắt vào một giọt dung dịch paranitroanilin 1% thành
tế bào hoá gỗ nhanh chóng nhuộm thành màu vàng cam, chuyển lát cắt vào một giọt
glycerin và quan sát dưới kính hiển vi.
2.1.3. Phản ứng lên thành tế bào hoá bần, cutin
Thành tế bào hoá bần (suberin) và cutin không cho phản ứng đặc
trưng của cellulose. Bần và cutin trong thành phần của thành tế bào có thể thấy
được khi nhuộm bằng các thuốc nhuộm đặc hiệu hoặc bằng các thuốc nhuộm dùng để
nhuộm chất béo.
- Phản ứng của KOH lên bần
Ðặt lát cắt trong KOH đậm đặc, thành tế bào hoá bần nhuộm
thành màu vàng, khi hơ nóng màu đậm lên phản ứng tiến hành trên phiến kính, nếu
đun đến sôi các lát cắt trong KOH từ thành tế bào xuất hiện các giọt màu vàng.
Trong trường hợp thành tế bào đồng thời hoá gỗ và hoá bần cần phải xử lý trước
lát cắt bằng nước javen sau đó rửa bằng dung dịch HCl 1% để loại lignin ra khỏi
thành tế bào và tiến hành phản ứng lên bần. Phản ứng này cũng xảy ra với cutin
nhưng chậm hơn. Có thể phân biệt thành tế bào hoá gỗ và hoá bần như sau: Xử lý
các lát cắt trong vòng 2-3 giờ bằng nước javen sau đó cho lát cắt vào thuốc thử
kẽm clorua - iốt (2.1.1.1.) tiến hành trên phiến kính, quan sát dưới kính hiển
vi sẽ thấy thành tế bào hoá gỗ nhuộm thành màu hoa cà, bần thành màu vàng.
- Phản ứng của H2SO4 lên cutin
Ðặt lát cắt vào một giọt H2SO4 đậm đặc
trên phiến kính, đậy lá kính và quan sát dưới kính hiển vi, cutin và các lớp
cutin ở lát cắt nhuộm thành màu vàng thẫm hoặc nâu.
- Nhuộm màu bần, cutin bằng thuốc nhuộm màu chất béo
Lát cắt đặt vào một giọt thuốc thử Sudan III đun nóng nhẹ để
rút ngắn quá trình nhuộm màu, thấm thuốc nhuộm bằng giấy lọc, cho lát cắt vào một
giọt glycerin, đậy lá kính, quan sát trên kính hiển vi: thành tế bào hoá bần và
cutin nhuộm thành màu đỏ cam.
Có thể tiến hành phản ứng tương tự với dung dịch đỏ Sarlac
0,1-0,2% trong cồn 70o. quá trình nhuộm màu 20-30 phút nếu không hơ
nóng hoặc nhanh hơn nếu hơ nóng nhẹ.
2.2. Các phản ứng lên cacbohydrat.
2.2.1. Phản ứng xác định đường với phenyl hydrazin
Thường tiến hành làm hai tiêu bản: trên phiến kính đặt các
lát cắt vào thuốc thử, đậy lá kính, tiêu bản thứ nhất để ở nhiệt độ phòng, tiêu
bản thứ hai hơ nóng trên nồi cách thủy trong vòng nửa giờ, sau đó làm lạnh,
trong thời gian đun trên cách thủy khi có đường các lát cắt và chất lỏng nhuộm
thành màu vàng và khi làm lạnh tiêu bản quan sát thấy xuất hiện tinh thể hình
kim vàng của ozazon tập hợp lại thành bó, hình sao v.v... Tiêu bản để lạnh
không đun tạo thành tinh thể ozazon chậm (trong vòng vài giờ, thậm chí vài
ngày) và phần lớn tạo thành tinh thể dạng cầu. Phản ứng với phenylhydrazin có
ưu điểm cho phép xác định vị trí của đường vì
các tinh thể tạo thành chỉ trong các tế bào chứa đường, hơn nữa phản ứng
cho phép phân biệt các dạng đường có trong cây vì khi phản ứng ở điều kiện thường
và đun cách thủy 10 phút chỉ tạo thành tinh thể ozazon với các đường đơn. Nếu
trong tế bào có đường đôi (saccaroze) thì tinh thể ozazon chỉ được tạo thành
khi đun nóng lâu (khoảng 1-2 giờ) đường đôi bị thủy phân tạo thành đường đơn và
tạo thành ozazon với phenyl hydrazin.
2.2.2. Xác định tinh bột
Tinh bột quan sát rất rõ trong nước và glycerin, do có tính
khúc xạ kép hạt tinh bột khi quan sát dưới kíng hiển vi phân cực có hiện tượng
chữ thập đen, nơi giao nhau của chữ thập là trung tâm phân lớp (rốn) của hạt.
Phản ứng với iốt là phản ứng màu duy nhất của tinh bột. Tùy điều kiện cụ thể mà
người ta sử dụng các dung dịch chứa iốt khác nhau. Ví dụ: Mayer, Lugol, Iốt/ Cloralhydrat, Iốt/ acid lactic. Ðể phát hiện tinh bột khi nó
có lượng rất nhỏ, ví dụ: trong lục lạp, hạt phấn, túi phôi dùng dung dịch Iốt đậm
đặc hơn (khoảng 2g/100 ml). Dung dịch Iốt/Cloralhydrat nhuộm tinh bột đồng thời
với làm sáng tiêu bản, tiện lợi để phát hiện tinh bột trong lục lạp của lá, có
thể quan sát trực tiếp mà không cần làm các lát cắt. Phản ứng được thấy rõ hơn
nếu lá, lát cắt được xử lý trước bằng cồn để chiết chất diệp lục. Iốt/acid
lactic được dùng chủ yếu khi xác định tinh bột của các dược liệu dưới dạng bột,
thuốc thử vừa có tính chất làm sáng, vừa nhuộm tinh bột. Một số chất có trong tế
bào thực vật (tanin) làm chậm phản ứng iốt với tinh bột. Phản ứng iốt với tinh
bột là phản ứng thuận nghịch, tinh bột nhuộm màu bởi iốt bị mất màu tương đối
nhanh nhất là khi đun nóng. Hầu hết tinh bột bị nhuộm bởi Iốt thành màu xanh,
song có một số cây có chứa tinh bột nhuộm với iốt thành màu đỏ hoặc đỏ tím gọi
là "tinh bột đỏ" mặc dù về mặt bản chất còn nhiều ý kiến chưa thống
nhất song nó có ý nghĩa quan trọng trong kiểm nghiệm dược liệu.
2.2.3. Phản ứng xác định Inulin
Inulin là hydratcacbon thuộc nhóm polisaccarit có tính chất
gần giống tinh bột song hoà tan trong dịch tế bào. Inulin có trong rễ nhiều cây
thuộc họ Cúc, họ Hoa chuông... Khi cố định nguyên liệu trong cồn Inulin tạo
thành các tinh thể hình dạng kích thước khác nhau tùy thuộc độ cồn và điều kiện
kết tinh, trong nước nóng các tinh thể inulin bị hoà tan. Xác định inulin trong
dược liệu tiến hành như sau: Dược liệu tươi cắt thành mẩu, ngâm trong cồn vài
ngày, lấy ra, cắt lát, lên kính trong cồn hoặc glycerin, quan sát dưới kính hiển
vi sẽ thấy các tinh thể inulin có hình dạng và kích thước khác nhau. Tinh thể
inulin có tính khúc xạ kép, thấy rõ dưới kính hiển vi phân cực, nếu tinh thể
inulin được tạo thành ở dạng cầu (kết tinh chậm) thì dưới kính hiển vi phân cực
sẽ thấy hiện tượng chữ thập đen như hạt tinh bột. Khi thêm nước và đun nóng
tinh thể inulin bị tan. Khi nghiền dược liệu khô thành bột có thể dễ dàng quan
sát dưới kính hiển vi các khối inulin có hình dạng, kích thước khác nhau.
2.2.4. Phản ứng thử chất nhầy
- Phản ứng tủa trong cồn và nở trong nước của chất nhầy
Lát cắt dược liệu tươi cho vào cồn, đậy lá kính, quan sát dưới
kính hiển vi. Chất nhầy thấy được trong các tế bào dưới dạng hạt khúc xạ ánh
sáng mạnh. Nếu thêm nước vào một phía của lá kính và phía kia hút cồn bằng một
mảnh giấy lọc có thể thấy chất nhầy dần dần trương phồng trong nước. Thay nước
bằng cồn quá trình xảy ra ngược lại.
- Phản ứng nhuộm kép
Lát cắt đặt vào dung dịch FeCl3 khoảng 20 phút
sau đó chuyển vào dung dịch xanh metylen
2-3 phút, rửa bằng nước, lên kính bằng glycerin, soi dưới kính hiển vi,
các tế bào có chứa chất nhầy bị nhuộm thành màu vàng, sợi thành màu xanh da trời,
mạch gỗ màu xanh lá cây.
- Xác định chất nhầy bằng mực tàu
Cho bột dược liệu vào một giọt mực tàu trên phiến kính, dùng
kim mũi mác dầm cho bột thấm đều mực tàu, đậy lá kính, quan sát dưới kính hiển
vi. Trên vi trường có màu xám tối (gần như đen) có những vết sáng của chất nhầy
(vì chất nhầy không thấm mực tàu).
2.3. Phản ứng thử chất béo
Chất béo chứa trong dược liệu là chất dự trữ, thường chứa
trong cây với tỷ lệ lớn. Khi nghiên cứu dược liệu chứa chất béo sử dụng dược liệu
tươi không cố định hoặc các dược liệu khô.
Chất béo dễ bị nhuộm màu bởi các thuốc nhuộm khác nhau.
Phương pháp nhuộm đơn giản nhất là dùng Sudan III. Ðặt lát cắt vào dung dịch
nhuộm, đậy lá kính và hơ nóng nhẹ để làm nhanh quá trình nhuộm, đem quan sát dưới
kính hiển vi. Nhuộm bằng Sudan III có thể tiến hành theo cách khác: Ngâm lát cắt
vào dung dịch nhuộm một ngày đêm sau đó rửa bằng cồn 500, đặt lát cắt lên phiến
kính trong glycerin và quan sát dưới kính hiển vi. Sudan III nhuộm chất béo
thành màu đỏ cam, các phản ứng nhuộm màu bằng các thuốc nhuộm khác tiến hành
tương tự song các phản ứng nhuộm màu chất béo không đặc trưng vì chúng nhuộm cả
tinh dầu, nhựa, cutin, suberin. Nhuộm màu chất béo bằng thuốc nhuộm huỳnh quang
là phương pháp có độ nhạy cao và cho khả năng xác đinh vị trí của chất béo
trong mô, tế bào chính xác hơn là sử dụng Sudan III. Thuốc nhuộm huỳnh quang
thích hợp nhất là 3,4-benzpyrene, focfin 3R và đỏ trung tính, các thuốc nhuộm
này được chất béo hấp thu mạnh. Ðể thu được kết quả có độ tin cậy cao cần tiến
hành phản ứng xà phòng hoá: lát cắt dược liệu được đặt vào dung dịch KOH 15%
trong nước và đun nóng nhẹ sau một thời gian các tinh thể hình kim (muối của
các acid béo) được tạo thành, đem quan sát trên kính hiển vi (phản ứng xà phòng
hoá theo Rozentaler). Phản ứng có thể thực hiện theo cách khác: trên phiến kính
đặt một giọt dung dịch KOH 15% và một giọt NH4OH 20% đặt lát cắt vào
hỗn hợp, đậy lá kính lên, mép lá kính viền bao quanh bằng parafin nóng chảy để
chống khô, qua 1-2 ngày xung quanh dầu tạo thành các tinh thể (muối của các acid béo) quan sát ở kính hiển
vi thường và kính hiển vi phân cực.
2.4. Phản ứng xác định tinh dầu
Tinh dầu là một hỗn hợp phức tạp của các chất. Trong cây
chúng định vị ở các túi có dạng khác nhau hay trong các tế bào đặc biệt. Có thể
nhận ra tinh dầu ở trong tiêu bản không cần sử dụng thuốc nhuộm, chúng có dạng
hạt, khúc xạ ánh sáng mạnh, khi quan sát giọt tinh dầu có thể có màu vàng nhạt,
vàng sẫm, xanh vàng hay nâu đỏ. Ðể nhuộm tinh dầu sử dụng thuốc nhuộm như là
nhuộm chất béo, nhựa (Sudan III) để phân biệt tinh dầu với chất béo, nhựa sử dụng
dung dịch xanh metyl trong nước (0,1 g xanh metyl/500 ml nước) các mẫu cắt đặt
vào thuốc thử sau vài phút rửa, đặt vào nước hoặc glycerin, đậy lá kính, soi dưới
kính hiển vi tinh dầu được nhuộm thành màu xanh. Dùng thuốc nhuộm xanh
indophenol cũng cho kết quả tương tự. Có thể phân biệt tinh dầu với chất béo,
nhựa dựa trên tính chất bay hơi, hoà tan của chúng: các mẫu đem đun sôi trong
nước tinh dầu bay hơi, chất béo không bay hơi cho phản ứng với thuốc nhuộm.
2.5. Phản ứng xác định nhựa
Nhựa có chứa trong cây ở các túi đặc biệt, các ống nhựa, đôi
khi kết hợp với tinh dầu. Ðể xác định nhựa thường sử dụng phản ứng nhuộm màu
song các phản ứng này không đặc trưng.
- Phản ứng với đồng acetat
Cho các mẩu dược liệu vào đồng acetat bão hoà, sau vài ngày
lấy ra, cắt lát, lên kính trong một giọt glycerin và quan sát dưới kính hiển
vi. Nhựa được nhuộm thành màu lục ngọc bích.
Một số thuốc nhuộm khác như Sudan III, xanh metyl ... nhuộm
màu nhựa song cũng nhuộm nhiều thành phần khác trong cây (chất béo, tinh dầu,
cutin).
2.6. Phản ứng thử saponin
Phát hiện saponin bằng phương pháp vi hoá không hoàn toàn chắc
chắn vì không có phản ứng đặc trưng nào có thể tiến hành trên mô thực vật. Phản
ứng tin cậy hơn cả là dựa vào tính chất phá huyết của saponin.
2.6.1. Xác định saponin theo tính chất phá huyết
Lát cắt dược liệu tươi đặt lên một mẩu gelatin huyết đậy lá
kính và để 30-40 phút. Khi có saponin trong dược liệu xung quanh lát cắt tạo
thành vùng đỏ, trong, gọi là "vùng tan huyết"
Ðiều chế gelatin huyết: cho 2-3 giọt huyền phù hồng cầu hay
máu loại fibrin trong dung dịch NaCl đẳng trương vào 2-3 ml dung dịch gelatin
6-8% sau khi gelatin đông kết dưới dạng lớp mỏng (dày 2-3 mm) cắt thành mẩu nhỏ,
gelatin huyết sau khi điều chế phải dùng ngay.
2.6.2. Phản ứng với antimon clorua
Lát cắt dược liệu tươi xử lý 2-3 phút bằng hơi amoniac và cố
định trong aceton, sau vài phút lấy ra, aceton bay hơi. Ðặt lên phiến kính, nhỏ
vào lát cắt một giọt dung dịch antimon clorua bão hoà trong cloroform, hơ nóng
nhẹ, cho một giọt dầu vaselin vào lát cắt, đậy lá kính và quan sát dưới kính hiển
vi. Saponin dưới tác dụng của antimon clorua cho màu đỏ điều đến đỏ tím và nhìn
rõ dưới dạng hạt, cục vón trong lớp vách của chất nguyên sinh.
2.7. Phản ứng thử alkaloid
Trong cây các alkaloid tồn tại dưới dạng hoà tan trong dịch
tế bào. Trong cây khô chúng bị hấp thu, vón vào các thành phần cấu trúc khác của
tế bào. Ðể nghiên cứu alkaloid thường dùng dược liệu khô hoặc dược liệu tươi vừa
thu hái. Tránh cho dược liệu tươi vào nước vì trong điều kiên này alkaloid dễ bị
phân hủy. Ðể giữ alkaloid có thể xử lý dược liệu tươi bằng cồn đun sôi để phá hủy
men.
Có thể phát hiện alkaloid bằng thuốc thử tạo tủa hay tạo
màu. Cần song song tiến hành phản ứng thử với các tiêu bản đối chứng đã rửa alkaloid
bằng cồn acid hoá. Thông thường đặt các lát cắt vào lọ nút kín 5-7 ngày với
dung dịch tartric 5% trong cồn, 2-3 ngày thay dung môi mới một lần.
Phản ứng tủa alkaloid: khi tiến hành phản ứng tủa có thể sử
dụng bất kỳ thuốc thử tạo tủa với alkaloid. Ví dụ: Dragendorff, Mayer, muối
Reinecke ... Kết quả tốt nhất thường thu được khi sử dụng dung dịch acid
picric, acid này tạo tinh thể picrat với nhiều alkaloid.
Phản ứng tủa alkaloid tiến hành trên phiến kính: đặt lát cắt
cây tươi vào một giọt thuốc thử, đậy lá kính, quan sát kết quả phản ứng dưới
kính hiển vi, so sánh với kết quả đối chứng.
Có thể tiến hành phản ứng theo cách khác: Ngâm các mẩu dược liệu
vào một trong các thuốc thử trên 1-2 tuần sau đó cắt lát, lên kính trong một giọt
glycerin, so sánh kết quả thu được với tiêu bản đối chứng.
Bằng phản ứng tạo tủa có thể xác định được vị trí của các
alkaloid trong các mô của cây.
Với dược liệu khô và bột dược liệu phát hiện alkaloid như
sau: đặt bột dược liệu nghiên cứu lên phiến kính, thêm 1-2 giọt acid acetic 5%,
đậy lá kính, hơ nóng nhẹ. Sau 1-2 phút đặt một lá kính thứ hai bên cạnh để kéo
chất lỏng sang, cất lá kính thứ nhất và lau sạch bột, cho một giọt thuốc thử
alkaloid (Dragendorff, Mayer, muối Reinecke) bên cạnh lá kính, thuốc thử thấm
vào dưới lá kính, phản ứng với dịch chiết, quan sát kết quả phản ứng dưới kính
hiển vi.
Một số alkaloid trong dược liệu có thể tiến hành xác định bằng
các phản ứng màu đặc hiệu hoặc quá trình vi thăng hoa (2.8.2.).
2.8. Phản ứng thử anthranoid
2.8.1. Phản ứng với kiềm
Lát cắt dược liệu đặt lên một giọt NaOH 5% hay NH4OH trên
phiến kính, thêm một giọt glycerin, đậy lá kính và quan sát dưới kính hiển vi.
Mô có chứa anthranoid nhuộm thành màu đỏ hay đỏ tím, màu đỏ dần dần phân tán
trên toàn bộ lát cắt. Màu rực rỡ chỉ tạo nên với dẫn chất của anthraquinon, dẫn
chất của anthron và anthranon với kiềm nhuộm thành màu vàng. Trong trường hợp
này màu có thể tăng lên bằng cách xử lý sơ bộ lát cắt bằng H2O2.
2.8.2. Quá trình vi thăng hoa
Cho một lượng nhỏ bột dược liệu chứa anthranoid vào một nắp
kim loại, đậy bằng một phiến kính, phía trên để giấy lọc hoặc bông thấm nước
làm lạnh, đun trên bếp điện (qua lưới amian) luôn thay bông, giấy lọc để quá
trình làm lạnh tốt. Anthranoid thăng hoa và ngưng tụ ở bề mặt dưới của phiến
kính. Thay phiến kính một số lần để lượng anthranoid thăng hoa ở mỗi phiến kính
không nhiều quá. Dưới kính hiển vi quan sát thấy các tinh thể, với các dược liệu
khác nhau thường cho các tinh thể có hình dạng và kích thước khác nhau, trong một
số trường hợp có thể dựa vào hình dáng, cách sắp xếp các tinh thể để xác định
dược liệu. Trong dung dịch KOH/cồn các tinh thể anthranoid hoà tan, thường cho
màu đỏ.
Quá trình vi thăng hoa có thể tiến hành để phát hiện acid
benzoic, một số hoạt chất thuộc nhóm coumarin, alkaloid, dẫn chất terpen và những
chất có khả năng thăng hoa khác có mặt trong dược liệu.
2.9. Phản ứng thử coumarin
Trong cây coumarin có thể ở dạng tự do hoặc dạng kết hợp
glycosid. Xác định coumarin trong dược liệu thường dựa vào phản ứng mở vòng
lacton, quá trình vi thăng hoa.
2.9.1. Quan sát huỳnh quang khi mở vòng lacton
Khi mở vòng lacton của coumarin bằng kiềm thì coumarin tạo
thành dẫn chất hydroxy cinamic ở dạng cis (acid cumarinic) chất này dưới tác dụng
của tia tử ngoại (kính hiển vi huỳnh quang) thì chuyển thành dạng trans (o.
cumaric acid) có huỳnh quang sáng hơn.
Cách tiến hành: đặt lát cắt dược liệu lên phiến kính, nhỏ
lên một giọt NaOH 5%, sấy nhẹ. Quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại nhỏ,
che một nửa lát cắt bằng mảnh kim loại. Sử dụng phương pháp huỳnh quang phản xạ,
quan sát lát cắt trong vài phút, cất mảnh kim loại sẽ thấy phần bị che có huỳnh
quang yếu hơn phần không bị che, khi tiếp tục quan sát thêm một thời gian sẽ thấy
huỳnh quang ở phần bị che dần dần sáng lên.
2.9.2. Quá trình vi thăng hoa (xem 2.8.2.)
Sau khi vi thăng hoa cho coumarin tác dụng với KI sẽ tạo
thành các tinh thể Iodocoumarin màu nâu sẫm hoặc tím. Quan sát các tinh thể
Iodocoumarin này dưới kính hiển vi huỳnh quang.
2.10. Phản ứng thử flavonoid
Số lượng flavonoid rất lớn, chúng có tính chất rất khác
nhau, không có phản ứng chung để phát hiện chúng trong tế bào thực vật. Chỉ có
thể tiến hành phân tích vi hoá flavonoid trong một số trường hợp cụ thể.
Xác định hesperidin: Hesperidin thuộc nhóm flavanon có ở nhiều
loại cây, trong tế bào sống chất này tồn tại ở dạng hoà tan trong dịch tế bào,
khi ngâm dược liệu chứa chất này vào cồn tuyệt đối hesperidin kết tinh trong tế
bào dưới dạng hình kim hay khối hình cầu hầu như không hoà tan trong nước, khó
tan trong nước nóng, điều này phân biệt các tinh thể hesperidin với inulin.
Tinh thể hesperidin không hoà tan trong benzen, cloroform, ete. Hesperidin có
thể phát hiện bằng amoniac hoặc kiềm loãng. Trong các dung dịch này chúng dễ
tan và nhuộm dung dịch thành màu vàng.
2.11. Phản ứng thử tanin
Trong thực vật tanin tồn tại dưới dạng hoà tan trong dịch tế
bào, một phần bị hấp thu bởi keo tế bào. Trong dược liệu khô tanin tạo thành
các hạt vô định hình màu vàng nâu.
2.11.1. Phản ứng xác định tanin bằng muối sắt
Xác định tanin bằng FeCl3 hoặc phèn sắt
amoni FeNH4(SO4)2
dưới dạng dung dịch 1% trong nước. Mô có chứa tanin nhuộm thành màu xanh đen
hay xanh lá cây đen với muối sắt. Sắc thái màu không ổn định vì trong tế bào có
các acid hữu cơ có thể biến đổi màu xanh lam thành xanh lá. Phản ứng tiến hành
trên phiến kính: cho lát cắt vào một giọt thuốc thử, đậy lá kính và quan sát
màu tiêu bản dưới kính hiển vi, màu nhanh chóng lan ra (phân tán) toàn bộ lát cắt.
2.11.2. Xác định tanin bằng dung dịch Kalibicromat
Ðây là phản ứng thường dùng để định vị tanin trong mô cây.
Dùng dung dịch Kali bicromat trong nước 5-10%. Ngâm dược liệu vào thuốc thử vài
ngày sau đó cắt lát. Trong tế bào có chứa tanin tạo thành tủa mịn màu xám và đỏ
nâu, màu đỏ nâu được tạo thành khi để lát cắt một thời gian. Sự tạo thành tủa bị
ngăn cản bởi các acid hữu cơ có trong cây (acid oxalic, acid citric, acid
malic, acid tartric) khi có các acid này chỉ thu được màu vàng nâu đồng nhất.
2.11.3. Xác định tanin bằng dung dịch Amonimolipdat (NH4)2MoO4
(Phản ứng Gardiner hay Viceling)
Ðặt lát cắt vào một giọt dung dịch thuốc thử, đậy lá kính,
quan sát dưới kính hiển vi. Dưới tác dụng của thuốc thử trong tế bào có chứa
tanin xuất hiện tủa vàng hoặc đỏ. Khi kiềm hoá (thêm NH4OH) thuốc thử
thâm nhập vào tế bào nhanh hơn. Phản ứng tương đối nhạy. Nhược điểm của phản ứng
là tủa dễ tan trong acid loãng và trong nước, thuốc thử không bền vững khi bảo
quản.
3. Phân tích huỳnh quang
3.1. Khái niệm về huỳnh quang và phân tích huỳnh quang
Một số chất khi dùng các tia sáng có bước sóng ngắn chiếu vào chúng sẽ phát sáng với bước
sóng dài hơn, nếu hiện tượng phát sáng đó chấm dứt ngay sau khi nguồn sáng kích
ứng thôi tác dụng thì gọi là sự phát huỳnh quang.
Nhiều cây thuốc có chứa hoạt chất có tính chất phát huỳnh
quang thuộc các nhóm khác nhau: coumarin, alkaloid, flavonoid ... vì vậy phương
pháp phân tích huỳnh quang có ý nghĩa rất lớn khi nghiên cứu dược liệu. Người
ta sử dụng một số loại đèn phát ra chùm tia có bước sóng ở vùng cực tím và các
kính lọc để tạo ra chùm tia kích ứng có bước sóng thích hợp.
Ánh sáng huỳnh quang có bước sóng lớn hơn bước sóng của ánh
sáng gây nên huỳnh quang (ánh sáng kích ứng). Huỳnh quang được tạo nên bởi tia
cực tím có bước sóng λ =365 nm nằm ở phần thấy được của phổ ánh sáng có thể có
màu từ tím đến đỏ. Khi kích thích huỳnh quang bằng tia tím xanh λ=400 nm có thể
tạo ra huỳnh quang từ xanh lá đến đỏ.
Ðộ sáng huỳnh quang (cường độ huỳnh quang) phụ thuộc vào nhiều
yếu tố:
- Chiều dày của lớp huỳnh quang, khi chiều dày càng lớn thì
độ sáng càng lớn, độ sáng huỳnh quang của dung dịch trong ống nghiệm lớn nhất
khi quan sát dọc theo trục ống. Ðộ sáng lớn nhất của tinh thể phát huỳnh quang
nhìn thấy được khi quan sát theo chiều dọc từ đầu đến cuối tinh thể.
- Nồng độ của dung dịch huỳnh quang: Khi nồng độ của các chất
tạo huỳnh quang nhỏ (10-4-10-5 g/ ml) cường độ huỳnh
quang của các dung dịch tăng lên tỷ lệ với sự tăng của nồng độ chất huỳnh
quang. Khi nồng độ cao hơn sự tăng huỳnh quang chậm hơn so với tăng nồng độ chất
huỳnh quang và tới một mức nào đó cường độ huỳnh quang không tăng mà còn giảm.
Quá trình phát huỳnh quang cũng bị ảnh hưởng (làm yếu đi) bởi
sự thay đổi (tăng) nhiệt độ hoặc sự có mặt của các chất lạ. KI là chất có tác dụng
làm giảm huỳnh quang điển hình, các muối của halogen khác và một số chất hữu cơ
như phenol, hydroquinol, rezocin, anilin, acid picric... cũng có tác dụng làm
giảm huỳnh quang. Cường độ và phổ huỳnh quang của các chất biến đổi rõ rệt khi
có những biến đổi nhỏ trong cấu trúc phân tử của chúng (phân ly, dime hoá, liên
kết với dung môi...) vì vậy cần chú ý tới ảnh hưởng của pH môi trường, bản chất
của dung môi...
Các phương pháp, kỹ thuật phân tích dựa trên hiện tượng huỳnh
quang, gọi là phân tích huỳnh quang được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
như sinh học, y học, nông nghiệp và các ngành kinh tế quốc dân khác.
Trong nghiên cứu dược liệu phân tích huỳnh quang được chia
thành hai phần: Phân tích huỳnh quang sơ bộ và phương pháp hiển vi huỳnh quang.
3.2. Dụng cụ để nghiên cứu huỳnh quang
Ðể tạo ra nguồn sáng kích ứng người ta thường sử dụng đèn thủy
ngân cao áp kết hợp với bộ lọc hoặc các đèn có bức xạ với bước sóng xác định.
Các đèn này được bố trí trong các hệ thống có cấu tạo phù hợp với mục đích sử dụng.
Khi nghiên cứu huỳnh quang sơ bộ nguồn sáng thường đặt trong một buồng, buồng
này có thể đưa vào các bản sắc kí, dược liệu bẻ gẫy để quan sát sự phát huỳnh
quang của chúng.
Phân tích huỳnh quang trong một số trường hợp có thể sơ bộ
đánh giá chất lượng nguyên liệu khi chất có hoạt tính sinh học trong chúng có
tính chất phát huỳnh quang (alkaloid, flavonoid, coumarin...). Khi đó sự biến đổi
tính chất huỳnh quang của nguyên liệu phản ánh sự biến đổi hàm lượng hay cấu
trúc của các hoạt chất trong chúng.
Bên cạnh quan sát huỳnh quang của bản thân nguyên liệu (huỳnh quang sơ cấp) có thể quan sát huỳnh quang được
tạo thành khi phản ứng của hoạt chất nguyên liệu với thuốc thử. Ví dụ: Khi quan sát flavonoid thường xử
lý bằng hơi amoniac, dung dịch kiềm để tăng huỳnh quang của chúng, trong trường
hợp này các thuốc thử không chỉ làm thay đổi cường độ mà cả phổ của huỳnh
quang. Khi phân tích huỳnh quang sơ bộ có thể dùng các nguồn sáng kích ứng có
bước sóng gần vùng cực tím sẽ thu được huỳnh quang có nhiều màu sắc. Nguồn sáng
kích ứng có bước sóng trong vùng xanh tím cho huỳnh quang có cường độ lớn song
dải phổ hẹp.
Ðể nghiên cứu sự phát huỳnh quang của các chất ở các mô, tế
bào thực vật sử dụng kính hiển vi huỳnh quang.
3.3. Chuẩn bị tiêu bản để nghiên cứu huỳnh quang
Tiêu bản để quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang có thể
làm từ nguyên liệu tươi hoặc khô. Nguyên liệu đã cố định trong hỗn hợp cồn -
glycerin hay các chất cố định khác không dùng để làm tiêu bản quan sát huỳnh
quang vì các chất huỳnh quang bị rửa trôi. Trường hợp các chất huỳnh quang hoà
tan không đáng kể trong chất cố định nhưng chúng bị phân tán làm thay đổi vị
trí ở trong mô, dễ dẫn tới các kết luận sai.
Ðể nghiên cứu dưới kính hiển vi huỳnh quang từ dược liệu người
ta làm các lát cắt, một số trường hợp sử dụng bột dược liệu khô vì trong bột
luôn gặp các mẩu mô theo tiết diện ngang hoặc dọc.
Khi làm tiêu bản để nghiên cứu dưới kính hiển vi huỳnh quang
cần chú ý rằng phương pháp này có độ nhạy rất cao, nguyên liệu cũng như phiến
kính, lá kính cần phải sạch, thuốc thử không bị lẫn tạp, các lát cắt cần phải
làm hết sức cẩn thận.
Làm tiêu bản từ cây tươi, cắt tay bằng lưỡi dao cạo, không cần
thiết phải mỏng. dùng giấy lọc thấm dịch tế bào từ các lát cắt, mỗi lần trước
khi cắt lát mới cần làm sạch dao để các chất trong dịch tế bào hay trong các
túi chứa không dính vào dao giây ra các mô và tế bào khác.
Lựa chọn chất lỏng để soi phụ thuộc vào thành phần hoá học của
đối tượng. Chất lỏng phải không được hoà tan các chất huỳnh quang. Nếu chất lỏng
soi hoà tan chất huỳnh quang thì chất lỏng sẽ phát huỳnh quang ảnh hưởng tới việc
quan sát huỳnh quang ở tiêu bản. Sau một thời gian vi phẫu ngâm trong chất lỏng
quan sát, một số chất phát huỳnh quang bị phân tán, để khắc phục người ta bỏ lá
kính ra, lấy vi phẫu rửa qua nước hoặc nước-glycerin sau đó lại lên kính trong
một giọt chất lỏng mới để quan sát. Dung dịch cloralhydrat sử dụng rộng rãi làm
dung dịch soi trong kỹ thuật hiển vi không dùng trong các trường hợp này vì nó
có tính chất làm tắt huỳnh quang. Ðể làm dung dịch soi thường sử dụng nước cất,
glycerin, dầu vaselin, để làm tiêu bản cố định dùng xiro đường, dung dịch 5%
polivinylancol. Cần phải kiểm tra trước để đảm bảo trong dịch soi không có mặt
các chất phát huỳnh quang. Các đối tượng phát huỳnh quang sáng rõ nhất trong không
khí vì vậy có thể nghiên cứu chúng không dùng dịch soi, để hạn chế quá trình
khô của lát cắt dùng parafin lỏng để bọc quanh mép lá kính. Các lát cắt dược liệu
khô cho kết quả tốt khi nghiên cứu dưới kính hiển vi huỳnh quang. Dược liệu khô
bảo quản tương đối tốt cấu trúc, chỉ có các mô được tạo thành từ các tế bào có
thành cellulose rất mỏng là dễ bị biến dạng khi khô vì mất nước. Khi sấy thường
không xảy ra sự thay đổi vị trí các chất có hoạt tính sinh học. Trở ngại lớn nhất
khi làm lát cắt từ dược liệu khô là độ bền cơ học của chúng, để nghiên cứu dưới
kính hiển vi huỳnh quang phải làm các lát cắt dày của vỏ, rễ, rễ củ, thân (dày
2-4 mm) những lát cắt mỏng hơn thường dễ bị vụn và gẫy. Các lát cắt khô tốt nhất
làm bằng cách cưa, khi cưa bụi sẽ bám chặt vào bề mặt, bịt các tế bào và các
khoang. Cần phải làm sạch bụi bằng dao cạo sao cho mô và tế bào vẫn giữ được
hình dạng của chúng. Gắn lát cắt vào phiến kính bằng parafin nung chảy. Quan
sát không cần chất lỏng thuận lợi khi sử dụng kính hiển vi huỳnh quang phản xạ.
Các lát cắt dày thuận tiện để tiến hành các phản ứng hoá học.
Các lát cắt mỏng hơn từ dược liệu khô có thể thu được sau
khi làm mềm nó trong buồng ẩm, song các lát cắt mỏng thường dễ vỡ vì vậy nên
quan sát dưới kính hiển vi trong nước, glycerin hay các dung môi thích hợp
khác.
Kỹ thuật nghiên cứu các tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh
quang về cơ bản không khác với phương pháp nghiên cứu sử dụng kính hiển vi thường.
Khi nghiên cứu các chất huỳnh quang tự nhiên cần sử dụng các chất chuẩn, các
tiêu bản đối chứng đã được loại rửa chất huỳnh quang bằng các dung môi khác
nhau.
Post a Comment